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納米金剛石作為自噬抑制劑,可以提高三氧化二砷在實體瘤中的療效

關鍵詞 納米金剛石 , 自噬抑制劑 , 腫瘤 , 砒霜|2019-11-25 09:38:01|技術信息|來源 英文文獻悅讀
摘要 說起三氧化二砷(Arsenictrioxide,ATO)大家都不陌生,它是砒霜中的主要成分,早在李時珍所著的《本草綱目》中便有記載:砒霜主治中風痰壅,瘧疾以及項上瘰疬。砒霜不僅僅在...

說起三氧化二砷(Arsenic trioxide, ATO)大家都不陌生,它是砒霜中的主要成分,早在李時珍所著的《本草綱目》中便有記載:砒霜主治中風痰壅,瘧疾以及項上瘰疬。

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砒霜不僅僅在中國古代有使用,在近代西方國家中也有使用。比較有名的記載是十八世紀二十年代英國人托馬斯·弗勒發明的弗勒溶液,其后來也被收入到英國藥典和美國藥典中。

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但是砷具有強烈的毒性,1903年英國制造啤酒過程中由于原料砷污染,導致6000人中毒70人死亡,1928年法國有4萬人由于面包和酒砷污染而中毒,1955年日本森永奶粉公司的配方生產過程中砷污染導致12131名新生兒中毒,130人死亡,等等。這一系列砷中毒事件使得砷劑的研究一度陷入低潮,直到2001年陳竺教授發表的文章——Arsenic trioxide, a therapeutic agent for APL. 才將砒霜從谷底撈出。

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然而,三氧化二砷ATO治療白血病的療效在實體瘤中卻不能復制,經研究發現主要原因是實體瘤細胞自噬水平較高,其與凋亡形成拮抗,阻礙實體瘤進入程序性死亡。那么是否可以通過抑制實體瘤自噬,使得ATO促凋亡作中占主導,最終使天平向凋亡傾斜?

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2018年10月9日發表在Nature Communications上,IF:11.978,通訊作者:樊春海,單位:上海交通大學化學化工學院

1.納米金剛石是一種十分強效的自噬抑制劑

多種納米粒子表現出不同的細胞自噬抑制作用,為了找到一個安全有效的納米粒子抑制劑,作者選用HepG2細胞檢測了納米金(AuNPs)、納米三氧化二鐵和四氧化三鐵、納米金剛石(NDs)等各種納米粒子的自噬抑制作用。結果發現NDs、AuNPs和納米四氧化三鐵增加LC3-Ⅱ的積累,以及自噬底物p62(圖1a)。為了進一步評估這些納米粒子的自噬抑制作用,作者用shRNA靶向作用于ATG5,ATG7。ATG5/7缺失減少了NP誘導的LC3轉化。免疫熒光結果也顯示傳統自噬抑制劑——氯喹CQ處理后導致黃色標記的LC3斑點增多。而NDs組紅色標記的LC3斑點(mCherry陽性,GFP熒光陰性的自溶酶體)增加,這表明干擾了溶酶體清除(圖1b)。因此,NDs與CQ有著不同的自噬抑制機制。CQ+NDs與NDs相比,LC3-Ⅱ增加,并且p62積累也增加,這進一步證實了NDs起到自噬抑制作用,以調節自噬通量和自體溶酶體通量(圖1c)。綜上,證實了NDs在細胞中的自噬抑制作用。并且進一步揭示NDs與CQ有著不同的自噬抑制機制,二者聯合應用可以提高自噬抑制作用。作者接下來探索NPS是否能夠影響ATO介導的HepG2凋亡。NDs和AuNPS增加了ATO介導的細胞凋亡,另外,ATG5/7缺失減少了NDs介導的ATO誘導的細胞凋亡(圖1d)。在確定了NDs的自噬抑制作用后,作者進一步探究其在自體吞噬體加工過程中的機制作用。結果發現NDs處理導致NUPR1水平呈時間依賴性降低(圖1e)。另外,ATG5/7缺失顯著性地減輕了NDs引起的NUPR1耗竭。綜上,證明了NDs通過損害細胞中NUPR1介導的自溶酶體滲透而起到自噬抑制劑的作用。

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圖1

2.ATO處理的HepG2自噬抑制的機制分析

作者接下來研究自噬抑制在ATO處理的HepG2細胞凋亡增強中的分子機制。

CQ+ATO聯合處理HepG2可以增強細胞毒性,相反,NB4(急性早幼粒細胞白血病細胞系,自噬水平低)與CQ和ATO聯合應用處理并沒顯示出明顯的細胞凋亡,這樣表明自噬在ATO處理的APL細胞中不起作用(圖2a、b)。

在證實了自噬抑制在HepG2中基于ATO的細胞毒性中起到重要作用后,作者進一步探索NDs如何影響ATO治療的HepG2。與CQ相似,當NDs添加到ATO處理的HepG2細胞中后,WB結果顯示LC-Ⅱ累計的增加以及p62降解的抑制(圖2c)。共聚焦結果進一步證明NDs的共處理顯著減少由ATO誘導的LC3小點的形成,同時增加了細胞中的LC3陽性點裝結構的積累。(圖2e)TEM成像結果顯示共處理可以顯著性減少ATO誘導的自噬體形成,并且誘導含有NDs的自溶體的積累。(圖2e)另外,共處理好觀察到細胞內存在許多液泡,并伴隨著caspase-3活性的增加(圖2e)。

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圖2

3.NDs作為自噬抑制劑可以提高基于ATO的體內治療療效

為了評估NDs在基于ATO治療中療效,作者進行了一系列的體內外實驗,從而評估NDs/ATO組合的治療的安全性。NDs組相比于CQ組,血液中的各項指標較為穩定,且基本處于正常范圍內(圖3a)。在原位瘤模型中,NDs/ATO的血液循環曲線幾乎每天保持恒定,并且每次給藥后1/24h內從血液中清除(圖3b)。此外,作者也檢測它們的體內生物分布和清除率,在給藥48小時后,NDs熒光信號顯示NDs主要分布在腫瘤體,肝臟和腎臟中(圖3c)。定量分析結果也顯示NDs在脾和肺中累積,而ATO主要分布在腫瘤體,心臟,肝,脾,肺和腎(圖3d)。絕大多數的NDs的累積在72小時后被清除了,而這個時間點又正好是下一次給藥的時間點(圖3d)。在證明NDs/ATO聯合治療療法的突出生物相容性和腫瘤靶向性,作者進一步探討NDs自噬抑制劑是否可以改善體內基于ATO的療法。與NS組相比,首次給藥后第91天,NDs/ATO組合將腫瘤重量降低至~33%,而單獨使用NDs或者ATO(0.75mgkg-1)的治療并沒有顯著影響腫瘤重量。對于1.5mgkg-1ATO組別,添加NDs可以將腫瘤重量從67%降低至9%,表明具有協同抗腫瘤作用(圖4a,b)。另外,NDs/ATO組合可以降低肝臟腫瘤相關癥狀,如黃疸,肝腹水,以及肝硬化(圖5a)。作者接下來探討了治療小鼠的存活率和健康狀況。在NDs與高劑量ATO共同治療的組中,小鼠存活150天以上。而與陰性對照組相比,單獨使用不同劑量的ATO治療只能提供有限的生存天數(圖4e)。陰性對照組或ATO治療組中的所有小鼠都死于疾病,實現長期生存的比例低于30%。此外,組織學分析,體重曲線和主要器官的系數表明,聯合治療方案沒有明確的副作用(圖4f,5b)。

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圖3

4.NDs+ATO短期和長期治療的研究

為了進一步比較NDs+ATO與ATO治療的短期與長期內腫瘤重量,肝損傷相關血清生化指標,作者選擇給藥后35天和91天作為短期與長期的天數。結果表明NDs+ATO聯合治療組的腫瘤比重隨時間降低,而ATO治療組腫瘤的重量比隨時間沒有明顯變化(圖5c)。

更有趣的是,NDs-ATO聯合治療組中的所有生化參數在35天時或多或少增加,最終恢復到正常小鼠91天時觀察到的范圍。相比之下,ATO治療組中的這些參數隨時間顯著增加(圖5d)。此外,NDs+ATO比CQ+ATO具有更高的治療效果。首次給藥后第91天進行腫瘤重量比分析,發現NDs+ATO可將腫瘤重量減少約91%,而CQ+ATO僅為~58%(圖4b)。CQ之所以療效較低原因可能是腫瘤微環境pH值較低,阻礙CQ發揮抑制自噬作用。

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圖4

5.NDs API增強肝癌ATO治療的分子機制的探索

作者認為,NDs+ATO聯合治療的安全性和有效性來源于對器官的自噬特異性抑制。將荷瘤小鼠進行了LC2Ⅱ和ATG13進行免疫染色,結果發現,接受治療的小鼠顯示出明顯的LC3Ⅱ和ATG13斑點,尤其是在腫瘤內部和周圍血管的周圍(圖4g)。因此,作者確證了NDs+ATO聯合治療后腫瘤中自噬通量的調節。WB和TEM結果均證實NDs有抑制肝癌細胞組織中ATO誘導的自噬(圖4c,6a)。TEM分析腫瘤結果也表明NDs在腫瘤部位的累積是由于增強的滲透性和保留效果(圖6a)。

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圖6

總結

砒霜,我國的一味傳統的中藥,具有良好的治療白血病的功效,但是對于實體瘤的治療卻一直沒有很好的效果。這篇文章通過對比APL與HepG2細胞之間的差異——自噬水平不同,從而提出科學家說——能否通過抑制實體瘤細胞自噬從而提高ATO對實體瘤發揮促凋亡作用?并且作者通過一系列的實驗證明了這個科學假說,擴大了ATO臨床上抗腫瘤的范圍,具有較高的臨床價值。但是,這其中的分子機理還可以做進一步探索。


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